伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕

前言
     伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带，然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察；这些边缘的细胞会开始进行迁移活动，并且zui终覆盖整个无细胞的区域，重新互相接触在一起。
 
 
传统实验方法
     细胞在培养皿内贴壁后，使用移液枪的枪头在贴壁细胞的中间划过，人为造成一道伤口（划痕），之后定时测量划痕的宽度，进而得到伤口愈合的细胞迁移数据。
 
实验缺点：
1.手动划痕，不能保证每次划痕的一致；
2.有时候在划细胞的同时会刮坏一片细胞，对划痕的边缘的细胞造成机械损伤；
3.如果培养皿底部还有包被蛋白的话，枪头划过，很可能伤害到包被，进而影响到细胞迁移，结果便很难判断是哪个因素造成了决定性的影响。
4.定时测量划痕的宽度，计算划痕宽度随时间推移的变化；在选取划痕测量点时，不可避免地引入了主观误差（人为选取了迁移结果符合实验预期的点）；
 
       综上，传统的伤口愈合方法总是重复性不佳，对于实验结果的阐述说服力不足。
       下面分享一种新方法，轻松得到笔直均一的划痕！
 
实验核心
       使用伤口愈合插件制造笔直均一的划痕（图一）。

实验方法     
一.实验材料
1) 细胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
2) 实验耗材:   ibidi 35 mm培养皿带伤口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
3) 细胞培养基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
4) 细胞消化试剂:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
5) 灭菌镊子
6) 倒置显微镜，如果需要进行连续的观测搭配镜载加热孵育系统
 
一.实验步骤
1.铺细胞（图二）
为了获得更好的实验结果，在做实验之前进行一次预实验，以确定需要使用的细胞悬液的密度。秋葵成人导航建议，将细胞悬液密度调整为24小时后正好可以长满每个插件的小孔。
● 将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
● 准备细胞悬液，调整悬液浓度为3*105 cells/ml，这样24小时后，细胞能刚刚长满单个小孔。
● 在ibidi细胞插件的每孔中加入70μl的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
● 在37。C培养箱中孵育24小时。

图二：A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。
 
1.形成“划痕”
当所有细胞都贴壁并且刚刚长满的时候，就可以开始伤口愈合实验了。用镊子将伤口愈合插件提出，之后加入新鲜的培养基，或者在培养基中加入刺激剂，然后观察伤口愈合的情况。
● 24小时后对细胞前一天种的细胞做镜检。细胞要贴壁并且是刚刚长满每个孔。长得过多移除插件时会带走很多细胞，长得过少，伤口愈合的效果很差。
● 如图三所示，小心的用镊子夹住插件的一个角，将插件移除。 

图三：用镊子移除插件
● 移除插件后，要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”（图四）。
● 小心的清洗细胞，之后加入2ml培养基进行培养。

图四 笔直均一的划痕
 
1.采集并分析图像
一般伤口愈合实验都是采集一张“划痕”的初始图像，再在实验结束时候采集一张“划痕”愈合的图像。秋葵成人导航建议可以在这个过程多做几个时间点，这样可以观测到细胞迁移随时间的变化特征。
● 在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像，“划痕”的方向在视野内为水平的或者垂直的。
● MCF-7细胞每半小时采集一张图片，一直持续到20小时。
● 采用ibidi伤口愈合分析软件，统计细胞的覆盖面积，做出曲线图，可以看到在大约11个小时的时候，细胞基本就已经长满了，接下来几个小时细胞覆盖面积都不会发生变化（图五）。

图五(a)  显微镜下观察细胞覆盖面积的变化

图五(b)  细胞覆盖面积的数据统计
 
 
实验总结对比
1.本实验方法能得到重复性更好的划痕（图六）；

图六 通过计算划痕的面积可以看出，在多次实验中，枪头划痕（左图）
制造的划痕面积数据波动大，重复性差；ibidi伤口愈合插件（右图）制造的划痕面积数据统一，重复性良好
 
 
2.不会刮坏细胞，也不会造成划痕的边缘的细胞有机械损伤；
 
3.不会伤害到培养皿底部的包被蛋白；

图一：左图表示枪头划过后，底部包被蛋白被划伤，细胞迁移结果受到底部不均一的影响。右图ibidi插件移除后底部的包被蛋白没有被破坏。
 
4.通过计算细胞覆盖面积得出细胞迁移结果，避免人为选取测量点，使数据更客观。1天内就能得到测量结果，实验分析更快更准确。